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摘要急性呼吸道感染是儿童最常见的感染性疾病，严重威胁儿童生命健康。快速准确的病原学诊断对于该类疾病的临床诊疗及防控具有重要意义。核酸检测方法因具有较高的灵敏度和特异性，得以快速地在临床推广应用，成为呼吸道感染病原体诊断的主要方法。为规范儿童呼吸道感染病原体核酸检测的临床应用，提升病原体的诊断水平，特组织相关领域专家，撰写《儿童呼吸道感染病原体核酸检测专家共识》，以指导儿童呼吸道感染病原体的核酸检测，整体提升儿童呼吸道感染病原体的诊断能力。急性呼吸道感染是儿童最常见的感染性疾病，急性下呼吸道感染是5岁以下儿童病死的首位原因，严重威胁儿童生命健康，对家庭和社会造成了严重的疾病负担［1］。儿童呼吸道感染的病原复杂多样，包括病毒、细菌、非典型病原体、真菌等（常见病原体见附录）。近年来，新型冠状病毒、禽流感病毒等新发再发呼吸道感染病原体也对儿童生命健康造成了严重威胁。明确感染病原有助于抗微生物药物的合理使用及呼吸道传染病的早发现、早隔离、早报告和早治疗。因此，快速准确的病原学诊断对于呼吸道常见感染性疾病的临床诊疗及防控具有重要意义。儿童呼吸道感染病原体检测方法包括分离培养、抗原检测、核酸检测和抗体检测等，各种方法均有各自的优缺点。由于病原体分离培养费时费力且敏感性较低，血清抗体检测因有窗口期不推荐使用，故呼吸道感染病原体的主要实验室诊断方法为抗原检测和核酸检测。核酸检测方法因在不同的疾病期均具有较高的灵敏度和特异性而得以快速地在临床推广应用，成为呼吸道感染病原体诊断的主要方法。多重核酸检测的合理使用，不仅有利于儿童呼吸道感染的病原学辅助诊断，同时也会为病医院内感染的防控提供强有力的支持；宏基因组测序技术（metagenomicsnextgenerationsequencing,mNGS）为未知病原的明确提供了可能。为规范儿童呼吸道感染病原体核酸检测的临床应用，提升儿童呼吸道感染病原体的诊断水平，实现国家卫生健康委制定的《年国家医疗质量安全改进目标》中“提高呼吸道病原核酸检测率”的目标，特组织临床微生物学、分子生物学、临床医学及检验医学等各相关领域专家，结合国内外文献最新进展，形成《儿童呼吸道感染病原体核酸检测专家共识》，以指导儿童呼吸道感染病原体的核酸检测，整体提升儿童呼吸道感染病原体诊断能力。1呼吸道病原体核酸检测方法病原体核酸检测方法以是否依赖于基因组序列特征分为基因组序列依赖性和非依赖性两类方法。病原体基因组序列依赖性核酸检测方法是根据已知的病原体基因组序列，设计特异性引物，靶向性地进行病原体核酸扩增和检测的方法，如常规的聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）。病原体基因组序列非依赖性核酸检测方法不需要根据病原体基因组序列设计特异性引物，而是对样本中的病原体序列进行高通量测序，将获得的序列与数据库中序列进行比对分析而确定病原体的方法，如mNGS。病原体核酸检测方法按照技术原理又可分为核酸扩增、核酸杂交、基因测序、规律成簇的间隔短回文重复（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR）技术等。核酸扩增包括PCR扩增、等温扩增技术等。以PCR为主的核酸扩增技术因其高效特异、使用灵活、操作相对简单且成本低的优势，成为当前呼吸道病原体核酸检测最普遍的核酸诊断方法。靶向多种病原体的多重标靶设计以及与核酸提取、扩增、结果读取一体化设备的研发应用，凸显核酸检测在病原体多重快速检测方面的优势。覆盖呼吸道感染常见病原体及耐药基因的核酸检测，可为临床提供病原体诊断依据，有助于优化诊疗。根据分析PCR产物的技术平台不同，又可分为荧光法、毛细管电泳法和质谱分析法等，其中荧光法是最常用的方法。核酸杂交，如基因固相和液相芯片技术以及基因测序技术因操作相对复杂，对设备及人员要求高，不适合在临床大规模使用，可根据实际情况选择应用。CRISPR技术是一种新兴的检测手段，尚未在病原核酸检测领域普及。常见的核酸检测方法概述如下。

1.1　病原体基因组序列依赖性核酸检测方法

采用靶向病原体基因组的引物，通过链特异性延伸、杂交、编辑等方式实现靶向目标序列的扩增，获得可被检测到的信号，这是病原体检测常用的技术方法。常用的方法包括以下几类。

1.1.1　实时荧光定量PCR（real-timePCR）　

实现了PCR从定性到定量的飞跃，使用荧光报告分子来检测每一轮PCR扩增过程中的产物。该方法将核酸扩增和检测步骤相结合，无需对扩增产物进行凝胶电泳，具有简单、特异性和灵敏性高、重复性好、定量准确、速度快等诸多优点。

1.1.2　等温扩增技术　

该技术具有操作简单、快速、高效、特异、无需专用设备的优点，较适用于基层和现场检测。代表性技术有环介导等温扩增（loopmediatedisothermalamplification,LAMP）和核酸序列依赖性扩增（nucleicacidsequencebasedamplification,NASBA）。LAMP使用具有链置换特性的BstDNA聚合酶，在等温条件下高效、快速、特异性扩增靶标序列［2］。基于LAMP技术开发的呼吸道病原体检测方法已有商品化试剂。NASBA技术是一种检测RNA的等温扩增方法，一般在42℃完成扩增，需反转录酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶和序列特异性引物来完成。NASBA尤其适用RNA病毒的检测［3-4］。目前有基于NASBA技术检测常见呼吸道病毒和流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌的方法，用于辅助诊断［5-6］。扩增产物的鉴定可以通过颜色、浊度、胶体金技术或与化学发光、荧光、芯片检测设备结合进行一体化检测。但等温扩增技术扩增体系的稳定性和方法的成熟度不及传统PCR方法。如LAMP技术对引物设计要求高，对扩增靶序列的长度有限制，一般不能进行长片段的扩增；NASBA技术反应体系和组分相对复杂，需要多种酶反应，增加了检测成本。

1.1.3　核酸即时检测（point-of-caretesting,POCT）技术　

核酸POCT因快速、自动、整合从细胞裂解、核酸提取扩增到产物分析的全部测定步骤，降低检测复杂性，有效防止交叉污染等优点，是病原学检测最受



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